親和層析空柱是生物大分子(如重組蛋白、抗體)純化中的核心工具，尤其適用於His-tag、GST或Protein A/G等特異性結合體係。與預裝柱相比，空柱具有成本低、靈活性高、可定製填料等優勢，但其性能高度依賴規範的操作流程。以下是標準化使用全流程詳解。
一、親和層析空柱準備與檢查
使用前需確認空柱無裂紋、接口密封良好，內壁光滑無殘留。用去離子水或20%乙醇衝洗柱體，排除顆粒雜質，並確保篩板孔徑(通常為20–50μm)與所選填料匹配，防止填料泄漏。
二、填料裝填(關鍵步驟)
漿料製備：將親和填料(如Ni-NTA瓊脂糖)充分混勻成均勻漿液，避免氣泡。
勻速裝柱：采用恒流泵或重力法將漿料一次性倒入空柱，保持連續流動，防止分層。推薦流速為100–300 cm/h(依填料說明書)。
沉降與平衡：讓填料自然沉降至所需床高，連接係統後以5–10倍柱體積(CV)的平衡緩衝液(如PBS或Tris-HCl)衝洗，直至pH和電導穩定。
三、上樣與洗脫
樣品需澄清無顆粒，避免堵塞。上樣流速宜慢(50–150 cm/h)，確保目標蛋白充分結合。隨後用洗滌緩衝液去除非特異性吸附雜質，最後用洗脫緩衝液(如含咪唑或低pH溶液)收集目標蛋白。
四、清洗與再生
每次運行後，依次用以下溶液處理：
1–2 CV 0.5 M NaOH(去除內毒素與強吸附雜質)；
1–2 CV平衡緩衝液再生結合位點；
20%乙醇保存(4℃避光)，防止微生物滋生。
五、親和層析空柱柱效驗證
定期通過丙酮或藍色葡聚糖測定柱效(理論塔板數)和對稱因子，若出現峰拖尾或壓力升高，提示需重新裝柱或更換篩板。
規範操作不僅能提升回收率與純度，還可延長空柱使用壽命達數十次以上。建議建立標準操作規程(SOP)並記錄每批次參數，確保實驗可重複性與工藝穩健性。
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